Chromatografija yra vienas iš medžiagų atskyrimo metodų. Jis naudojamas vėlesnei kokybinei ir kiekybinei mikrodalelių fizinių ir cheminių savybių analizei. Šios technologijos variantas yra afininė chromatografija. Idėja diferencijuoti b altymų junginius naudojant molekulinio giminingumo savybę moksle žinoma jau kelis dešimtmečius. Tačiau jis buvo sukurtas tik pastaraisiais metais, kai buvo pradėtos naudoti labai porėtos hidrofilinės medžiagos, naudojamos kaip matrica. Šis metodas leidžia spręsti tiek analitinius (medžiagų atskyrimo ir jų identifikavimo), tiek paruošiamuosius (valymas, koncentravimas) uždavinius.
Essence
Afinitetinė chromatografija (iš lotyniško žodžio affinis – „gretima“, „susijusi“) yra pagrįsta afiniteto sąveika, kuri yra labai specifinių ryšių tarp tarpinės molekulės (ligando arba afinanto) ir tikslinės molekulės susidarymas. Šie mechanizmai yra plačiai paplitę gamtoje (tarpininkų arba hormonų ir receptorių, antikūnų irantigenai, polinukleotidų hibridizacija ir kiti procesai). Medicinoje afininė chromatografija praktiniais tikslais naudojama nuo 1951 m.
Komponentai yra atskirti taip:
- darbinis tirpalas, kuriame yra izoliuojama medžiaga, leidžiamas per sorbentą;
- ligandas, nusodintas ant sorbento matricos, išlaiko šią medžiagą;
- jis yra koncentruotas (kaupimas);
- Išskirtos medžiagos ekstrahavimas iš sorbento plaunant tirpikliu.
Šis metodas leidžia išskirti visas ląsteles. Skirtumas nuo tradicinės sorbcinės chromatografijos yra tas, kad izoliuotas komponentas stipriai biospecifiškai jungiasi su sorbentu, kuriam būdingas didelis selektyvumas.
Adsorbentai
Šios medžiagos naudojamos kaip adsorbentai:
- Gelio junginiai agarozės, polisacharido, gaunamo iš agaro, pagrindu. Dažniausiai naudojamos 3 rūšys: sefarozė 4B, CL (kryžminė agarozė) ir affi-gel. Pastaroji kompozicija yra modifikuotas agarozės ir poliakrilamido gelis. Jis pasižymi didesniu biologiniu inertiškumu, dideliu cheminiu ir terminiu atsparumu.
- Silicis (silikagelis).
- Stiklas.
- Organiniai polimerai.
Siekiant pašalinti mechanines kliūtis ligando sąlyčio metu, naudojamos papildomos medžiagos, skirtos atskirti jį nuo nešiklio (peptidai, diaminai, poliaminai, oligosacharidai).
Įranga
Giminės chromatografijos įrangą sudaro šie pagrindiniai įrenginiai:
- mobiliosios fazės (eliuento) saugojimo talpyklos;
- aukšto slėgio siurbliai vidutiniam tiekimui (dažniausiai stūmokliniai);
- filtras eliuentams valyti nuo dulkių;
- dozavimo prietaisas;
- chromatografinė kolonėlė mišinio atskyrimui;
- detektorius, skirtas aptikti atskirtus komponentus, paliekančius stulpelį;
- chromatogramų įrašymo įrenginiai ir mikroprocesoriaus blokas (kompiuteris).
Siekiant sumažinti ištirpusio oro kiekį, helis pirmiausia praleidžiamas per judriąją fazę. Norint pakeisti eliuento koncentraciją, įrengiami keli programuotojo valdomi siurbliai. Chromatografinės kolonėlės gaminamos iš nerūdijančio plieno (siekiant didesnių atsparumo korozijai reikalavimų), stiklo (universalus variantas) arba akrilo. Paruošimo tikslais jų skersmuo gali svyruoti nuo 2 iki 70 cm. Analitinėje chromatografijoje naudojamos Ø10-150 µm mikrokolonėlės.
Siekiant padidinti detektorių jautrumą, į mišinį įvedami reagentai, kurie prisideda prie medžiagų, kurios sugeria daugiau spindulių ultravioletinėje arba matomoje spektro srityje, susidarymą.
Metodika
Yra 2 pagrindiniai skysčių giminingos chromatografijos tipai:
- Kolonėlė, kurioje kolonėlė užpildoma stacionaria faze ir per ją srautu praleidžiamas mišinyseliuentas. Atsiskyrimas gali įvykti veikiant slėgiui arba gravitacijai.
- Plonas sluoksnis. Eliuentas juda išilgai plokščio adsorbento sluoksnio, veikiamas kapiliarinių jėgų. Adsorbentas tepamas ant stiklo plokštės, keramikos arba kvarco strypo, metalinės folijos.
Pagrindiniai darbo etapai:
- adsorbento paruošimas, ligando fiksavimas ant nešiklio;
- atskyrimo mišinio padavimas į chromatografinę kolonėlę;
- mobiliosios fazės įkėlimas, komponentų surišimas ligandu;
- fazės pakeitimas, kad būtų izoliuota surišta medžiaga.
Kelionės tikslas
Giminė chromatografija naudojama šių tipų medžiagoms išskirti (naudojamo ligando tipas nurodytas skliausteliuose):
- fermentinių inhibitorių, substratų ir kofaktorių (fermentų) analogai;
- bioorganinės medžiagos su genetinio svetimumo požymiais, virusai ir ląstelės (antikūnai);
- didelės molekulinės masės angliavandeniai, monosacharidų polimerai, glikoproteinai (lektinai);
- branduoliniai b altymai, nukleotidiltransferazės (nukleorūgštys);
- receptoriai, transportavimo b altymai (vitaminai, hormonai);
- b altymai, sąveikaujantys su ląstelių membranomis (ląstelėmis).
Ši technologija taip pat naudojama imobilizuotiems fermentams gauti, o juos sujungus su celiulioze galima gaminti imunosorbentus.
DNR surišančių b altymų chromatografija
DNR surišančių b altymų išskyrimas atliekamas naudojantheparino. Šis glikozaminoglikanas gali surišti daugybę molekulių. Šios grupės b altymų afininė chromatografija naudojama tokioms medžiagoms išskirti kaip:
- transliacijos inicijavimo ir pailgėjimo veiksniai (nukleorūgščių molekulių ir b altymų sintezė);
- restriktazės (fermentai, atpažįstantys tam tikras sekas dvigrandėje DNR);
- DNR ligazės ir polimerazės (fermentai, kurie katalizuoja dviejų molekulių susijungimą, kad susidarytų naujas cheminis ryšys ir dalyvauja DNR replikacijoje);
- serino proteazės inhibitoriai, kurie atlieka svarbų vaidmenį imuniniuose ir uždegiminiuose procesuose;
- augimo veiksniai: fibroblastai, Schwann, endotelis;
- tarpląstelinės matricos b altymai;
- hormonų receptoriai;
- lipoproteinai.
Orumas
Šis metodas yra vienas specifiškiausių reaktyvių junginių (fermentų ir didesnių agregatų – virusų) išskyrimui. Tačiau jis naudojamas ne tik biologiškai aktyvioms medžiagoms išskirti.
Antikūnų aptikimas nedideliais kiekiais, kiekybinis poliadenilo rūgšties įvertinimas, greitas dehidrogenazių molekulinių masių nustatymas, tam tikrų teršalų pašalinimas, neaktyvios tripsino formos aktyvacijos kinetikos, žmogaus molekulinės struktūros tyrimas. interferonai – tai ne visas sąrašas tyrimų, kuriuose naudojamas afinitetas.chromatografija. Naudojimas klinikoje yra dėl jos pranašumų, tokių kaip:
- Efektyvi valymo galimybėb altymai, polisacharidai, nukleorūgštys. Jie šiek tiek skiriasi savo fizinėmis ir cheminėmis savybėmis ir praranda aktyvumą hidrolizės, denatūravimo ir kitų apdorojimo būdų, naudojamų kitais metodais, metu.
- Medžiagų atskyrimo greitis, proceso dinamiškumas.
- Disociacijos konstantoms nustatyti nereikia specialaus fermentinio gryninimo ir homogenizavimo izofermentais.
- Galima atskirti daugybę medžiagų.
- Mažas ligandų suvartojimas.
- Galimybė atskirti medžiagas dideliais kiekiais.
- Grąžinamas biologinių makromolekulių surišimo procesas.
Šią techniką galima derinti su kitais, kad būtų sukurtas papildomas laukas (gravitacinis, elektromagnetinis). Tai leidžia išplėsti technines chromatografijos galimybes.
Fermentinė inžinerija
Šio metodo dėka prasidėjo aktyvus naujos biotechnologijos šakos – fermentų inžinerijos – kūrimas.
Afinitetinė chromatografija fermentų išskyrimui turi šiuos privalumus:
- fermentų gavimas dideliais kiekiais per trumpesnį laiką, todėl jų kaina sumažėja;
- fermentų imobilizavimas gali žymiai išplėsti jų taikymo sritį medicinoje ir pramonėje;
- Fermentų susiejimas su netirpiu kietu pagrindu leidžia ištirti mikroaplinkos įtaką ir reakcijų kryptį, kurios atlieka svarbų vaidmenį natūraliuose ir fiziologiniuose procesuose.
