Rekombinantinė DNR yra molekulės, suformuotos laboratoriniais genetinės rekombinacijos metodais, siekiant sujungti genetinę medžiagą iš kelių š altinių. Tai įmanoma, nes visų organizmų DNR molekulės turi tą pačią cheminę struktūrą ir skiriasi tik nukleotidų seka joje.
Kūrimas
Molekulinis klonavimas yra laboratorinis procesas, naudojamas rekombinantinei DNR sukurti. Tai vienas iš dviejų plačiausiai naudojamų metodų kartu su polimerazės grandinine reakcija (PGR). Tai leidžia valdyti bet kurios konkrečios eksperimentuotojo pasirinktos DNR sekos replikaciją.
Rekombinantinės DNR metodai turi du esminius skirtumus. Viena iš jų yra ta, kad molekulinis klonavimas apima replikaciją gyvoje ląstelėje, o PGR – in vitro. Kitas skirtumas yra tas, kad pirmasis metodas leidžia iškirpti ir įklijuoti DNR sekas, o antrasis yra sustiprintas nukopijuojant esamą tvarką.
Vektoriaus DNR
Rekombinantinei DNR gauti reikalingas klonavimo vektorius. Jis gaunamas iš plazmidžių arba virusų ir yra palyginti mažas segmentas. Molekulinio klonavimo vektoriaus pasirinkimas priklauso nuo organizmo šeimininko pasirinkimo, klonuojamos DNR dydžio ir nuo to, ar turi būti ekspresuojamos svetimos molekulės. Segmentai gali būti derinami naudojant įvairius metodus, pvz., restrikcijos fermento / ligazės klonavimą arba Gibsono surinkimą.
Klonavimas
Standartiniuose protokoluose klonavimas apima septynis veiksmus.
- Pasirinkite organizmą šeimininką ir klonavimo vektorių.
- DNR vektoriaus gavimas.
- Klonuotos DNR susidarymas.
- Rekombinantinės DNR sukūrimas.
- Įvedant jį į šeimininko organizmą.
- Jo turinčių organizmų pasirinkimas.
- Klonų su norimais DNR intarpais ir biologinėmis savybėmis pasirinkimas.
Po transplantacijos į šeimininko organizmą svetimos molekulės, esančios rekombinantiniame konstrukcijoje, gali būti išreikštos arba ne. Ekspresijai reikia pertvarkyti geną, įtraukiant sekas, kurios yra būtinos DNR gamybai. Jį naudoja pagrindinio kompiuterio vertimo aparatas.
Kaip tai veikia
Rekombinantinė DNR veikia, kai ląstelė-šeimininkė ekspresuoja b altymą iš rekombinantinių genų. Išraiška priklauso nuo to, ar genas yra apsuptas signalų rinkiniu, pateikiančiu nurodymus jo transkripcijai. Jie apima promotorių, ribosomų surišimą ir terminatorių.
Problemos kyla, jei genasyra intronų arba signalų, kurie veikia kaip bakterijų šeimininko terminatoriai. Tai veda prie priešlaikinio nutraukimo. Rekombinantinis b altymas gali būti netinkamai apdorotas, sulankstytas arba suskaidytas. Jo gamyba eukariotinėse sistemose dažniausiai vyksta mielėse ir siūliniuose grybuose. Naudoti gyvūnų narvus sunku, nes daugeliui žmonių reikia tvirto atraminio paviršiaus.
Organizmų savybės
Organizmai, kuriuose yra rekombinantinių DNR molekulių, turi normalius fenotipus. Jų išvaizda, elgsena ir medžiagų apykaita dažniausiai nesikeičia. Vienintelis būdas įrodyti rekombinantinių sekų buvimą yra ištirti pačią DNR naudojant polimerazės grandininės reakcijos testą.
Kai kuriais atvejais rekombinantinė DNR gali turėti žalingą poveikį. Taip gali nutikti, kai jo fragmentas, kuriame yra aktyvus promotorius, yra šalia anksčiau tylėjusio šeimininko ląstelės geno.
Naudoti
Rekombinantinės DNR technologija plačiai naudojama biotechnologijose, medicinoje ir moksliniuose tyrimuose. Jo b altymų ir kitų produktų galima rasti beveik kiekvienoje Vakarų vaistinėje, veterinarijos klinikoje, gydytojo kabinete, medicinos ar biologijos laboratorijoje.
Dažniausiai taikoma fundamentiniams tyrimams, kur technologija yra labai svarbi daugeliui šiandieninio darbo biologijos ir biomedicinos moksluose. Rekombinantinė DNR naudojama genams identifikuoti, kartografuoti ir sekti bei juos nustatytifunkcijas. rDNR zondai naudojami genų ekspresijai atskirose ląstelėse ir ištisų organizmų audiniuose analizuoti. Rekombinantiniai b altymai naudojami kaip reagentai laboratoriniuose eksperimentuose. Kai kurie konkretūs pavyzdžiai pateikiami toliau.
Rekombinantinis chimozinas
Chimozinas yra fermentas, reikalingas sūriui gaminti. Tai buvo pirmasis pramonėje naudojamas genetiškai modifikuotas maisto priedas. Mikrobiologiškai pagamintas rekombinantinis fermentas, struktūriškai identiškas veršelių kilmės fermentui, yra pigesnis ir gaminamas didesniais kiekiais.
Rekombinantinis žmogaus insulinas
Praktiškai pakeistas iš gyvūninės kilmės (pvz., kiaulių ir galvijų) gauto insulino nuo insulino priklausomo diabeto gydymui. Rekombinantinis insulinas sintetinamas žmogaus insulino geną įvedant į Eterichia genties arba mielių bakterijas.
Augimo hormonas
Skirta pacientams, kurių hipofizė negamina pakankamai augimo hormono normaliam vystymuisi palaikyti. Prieš atsirandant rekombinantiniam augimo hormonui, jis buvo gautas iš lavonų hipofizės. Dėl šios nesaugios praktikos kai kuriems pacientams išsivystė Creutzfeldt-Jakob liga.
Rekombinantinis krešėjimo faktorius
Tai kraują krešantis b altymas, skiriamas pacientams, sergantiems hemofilija ir kraujavimo sutrikimais. Jie nesugeba gamintiVIII faktoriaus pakankamu kiekiu. Prieš sukuriant rekombinantinį VIII faktorių, b altymas buvo gaminamas apdorojant didelius daugelio donorų žmogaus kraujo kiekius. Dėl to kilo labai didelė rizika užsikrėsti infekcinėmis ligomis.
ŽIV infekcijos diagnozė
Kiekvienas iš trijų plačiai naudojamų ŽIV infekcijos diagnozavimo metodų buvo sukurtas naudojant rekombinantinę DNR. Atliekant antikūnų tyrimą, naudojamas jos b altymas. Jis nustato ŽIV genetinės medžiagos buvimą naudojant atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininę reakciją. Testą sukurti tapo įmanoma dėl molekulinio klonavimo ir ŽIV genomų sekos nustatymo.
