PGR arba polimerazės grandininė reakcija yra sudėtinga laboratorinė technika, plačiai naudojama medicinoje ir kitose mokslo srityse. PGR diagnostika vienu metu tapo tikru mokslo proveržiu.
Aprašymas
Kiekybinė PGR yra realaus laiko PGR tipas.
Tai suprantama kaip PGR variantas, kuriame nuolat registruojama reakcijos kinetika, todėl galima kokybiškai įvertinti specifinių DNR nukleotidų sekų kiekį sudėtingame molekuliniame mišinyje.
Kiekybinis PGR metodas bus išsamiau aptartas toliau.
Analizės esmė
Infekcijoms diagnozuoti ypač dažnai taikomi kultūriniai ir serologiniai metodai. Pagal pirmąjį nustatomi antikūnai prieš infekcinį patogeną kraujo serume. Antrajame iš sergančio žmogaus paimta biologinė medžiaga naudojama specifinei terpei, palankiai patogenų kolonijoms augti, sėti. Diagnostika abiejosebyla gali trukti kelias dienas ar savaites.
PGR tyrimas gali būti atliekamas naudojant įvairias biologines medžiagas, gautas iš sergančio žmogaus. Kraujas ir kitos patologinės, fiziologinės ir biologinės terpės bei skysčiai veikia kaip mėginiai. Galite atlikti PGR išmatas arba šlapimą.
Atipinės ir virusinės infekcijos dažniausiai diagnozuojamos atliekant kiekybinį PGR, nes jas gali būti nelengva diagnozuoti dėl specifinio jų išprovokuoto patologinio proceso pobūdžio. Norint nustatyti tokias infekcijas, reikia laiko, per kurį organizme pradeda gamintis serologiniais metodais nustatyti antikūnai. Tačiau kai kuriais atvejais tai nepriimtina.
Atlikimo būdas
PGR metodas – laboratorinis infekcijos nustatymas mėginiuose, išskirtuose iš paciento (in vitro).
Norint atlikti polimerazės grandininę reakciją, reikalingas specialių reagentų rinkinys.
Tidomoji medžiaga įpilama į mėgintuvėlius su reagentais. Mėgintuvėliai dedami į specialų aparatą – PGR stiprintuvą, kuris skirtas norimų RNR ar DNR fragmentų amplifikacijai (skaičiui padidinti), PGR stiprintuvas veikia cikliniu režimu. Bet kuriame cikle, jei mėginiuose yra patogeno RNR arba DNR seka, tai tirpale susikaupia vis daugiau šių nukleorūgščių dalelių kopijų. Galite nustatyti patogeno buvimą ir jo kiekį mėginiuose.
PGR tipai
Kokybinė PGR analizė leidžia gauti tokį rezultatą:
- neigiamas, kai dominančio patogeno mėginiuose nerasta;
- teigiamas, jei mėginiuose randamos sekos, būdingos konkrečiam patogenui.
Turėdami teigiamą PGR rezultatą, galime 95 % tikslumu kalbėti apie diagnozuotą infekciją. Tuo pačiu metu diagnostikos tikslais naudojamų PGR rinkinių tikslumas siekia 100%.
Paprastai 5 % neteisingų rezultatų nulemia žmogiškasis faktorius. Pavyzdžiui, analizės ir reagentų laikymo technikos pažeidimai gali žymiai sumažinti tyrimo tikslumą.
Kiekybinė PGR apibrėžia viruso krūvio sąvoką. Galima nustatyti, kiek patogeno DNR rinkinių buvo iš paciento paimtuose mėginiuose.
Infekcijos sunkumas yra tiesiogiai proporcingas jų skaičiaus padidėjimui. Taip pat galite nustatyti gydymo sėkmę, kad sumažintumėte virusų kiekį.
PGR biomedžiagos pateikimas
Kiekybinė PGR atliekama klinikoje, daugiausia ryte. Vizito pas gydytoją metu pacientui bus pasakyta, ką reikia paimti: įbrėžimą, tepinėlį, šlapimą ar kraują. PGR gali aptikti patogenus neatsižvelgiant į medžiagos užterštumo lygį.
Norint gauti teigiamą analizę, teoriškai mėginiuose turi būti tik vienas patogenas. Praktiškai jie stengiasi sukurti dar palankesnes sąlygas. Tam yra keletas rekomendacijų:
- jei jie nubraukia arba paima tamponą nuo lytinių organųorganus, turite susilaikyti nuo intymių santykių likus trims dienoms iki tyrimo;
- prieš analizę negalima nusiprausti antibakteriniais vaistais arba nusiprausti;
- 3 valandas prieš paimant tepinėlį iš šlaplės, turite būti kantrūs ir neištuštinti žarnyno.
Duodami kraujo nesilaikyti šių taisyklių.
Kaip interpretuojami kiekybinės PGR analizės rezultatai?
Gautų rezultatų kiekybinis įvertinimas
Daugelyje klinikinių situacijų iškyla gydymo veiksmingumo ir (arba) patologinio proceso dinamikos problema. Tokie klausimai ypač aktualūs tiriant žmones, sergančius lėtinėmis infekcijomis (žmogaus imunodeficito virusu, hepatitais B ir C). Diagnozuojant jie grindžiami tuo, kad amplikonų (PGR produktų) kaupimasis yra proporcingas norimo geno kopijų buvimui analizuojamame mėginyje.
Žinoma, atsižvelgiant į kiekybinės PGR rezultatus, atliekama gelio elektroforezės būdu, tiriant specialių PGR signalų intensyvumą. Taip pat būtina sąlyga norint teisingai kiekybiškai įvertinti gautus rezultatus yra teigiami patikimi kontroliniai mėginiai, kuriuose yra žinomas norimo geno kopijų skaičius (pavyzdžiui, tūkstantis hepatito C geno kopijų vienai PGR reakcijai). Keli serijiniai kiekybinės kontrolės skiedimai leidžia generuoti kalibravimo kreives ir yra naudojami klinikinių mėginių klinikinių genokopijų turiniui įvertinti.
Apibrėžiant kiekybinę PGR, pagrindinis pasiekimas buvo sukūrimasfluorescenciniai DNR zondai, kurie į reakcijos mišinį pridedami vienu metu su paprastais pradmenimis ir leidžia laiku sekti PGR procesą, tai yra PGR realiuoju laiku.
TaqMan metodika reiškia fluorescencinių DNR zondų, būdingų vidurinei amplikono daliai ir turinčių dvi etiketes galuose, sintezę. Viena iš jų yra fluorescencinė etiketė, antra – šios fluorescencijos gesinimo molekulė.
Specialus prietaisas, kuris yra fluorimetro ir termobloko stiprintuvo hibridas, atlieka nuolatinius fluorescencijos matavimus kiekviename mėgintuvėlyje (realaus laiko PGR principas). Po 20–40 PGR ciklų bus gautos individualios kiekvieno mėginio kreivės. Norimo geno, esančio tiriamajame mėginyje, kopijų skaičių galima apskaičiuoti pagal kalibravimo kreives su kontroliniais mėginiais.
Be to, svarbi PGR įgyvendinimo fluorescenciniu metodu ypatybė yra ta, kad, atsižvelgiant į rezultatus, nereikia atidaryti mėgintuvėlių su PGR mišiniu. Tai sumažina kambario užteršimo amplifikacijos produktais galimybę ir nereikia skirti specialių darbo zonų elektroforezei.
Ką rodo kiekybinis PGR nuorašas?
Kas atrandama?
Taikant tokį metodą kaip kiekybinė PGR, nustatomi kokybiniai genų pokyčiai: intarpai, delecijos ir taškinės mutacijos. Tačiau kai kurių paveldimų sutrikimų atveju atitinkami simptomai atsiranda dėl tam tikrų genų kiekio pasikeitimo.
AčiūKiekybinė analizė suteikia skaitinį rezultatą, dažniausiai TV / ml. Tai reiškia, kad viename tiriamojo mėginio mililitre buvo rastas tam tikras patogeno RNR arba DNR kopijų skaičius, išmatuotas tarptautiniais vienetais.
Priklausomai nuo masto, diagnozuojamas infekcijos sunkumas. Kraujas paprastai tiriamas viruso kiekiui nustatyti, nes ligos metu virusai kraujyje laisvai juda.
Funkcijos
Kiekybinė PGR atliekant kraujo tyrimą turi dvi ypatybes.
- Analizė atliekama naudojant pradmenis arba dezoksiribonukleozidų trifosfatus, kurie yra pažymėti fluorescencine arba radioaktyvia etikete, kad būtų galima tiksliai nustatyti susidariusio PGR produkto kiekį.
- PGR procese reakciją užbaikite anksti, kol pasirodys per daug PGR produktų. Taip yra dėl to, kad paskutinėje soties stadijoje, kai yra daug PGR produktų, tiek pats fermentas, tiek substratai veikia kaip šios reakcijos ribojančios grandys. Kito PGR ciklo pabaiga tokiomis sąlygomis nebepasižymi PGR produktų skaičiaus padvigubėjimu, išlyginami nereikšmingi kiekybiniai skirtumai tarp skirtingų mėginių, kurie gana aiškiai apibrėžiami ankstyvosiose stadijose, praėjus eilę reakcijos ciklų..
PGR diagnostikos kaina
PGR tyrimas kainuoja, kuris priklauso nuo to, kokia infekcija bus tiriama, nuo analizės metodikos ir tiriamosios medžiagos. Norėdami nustatyti vieną infekciją, turėsite pasiduoti200-800 rublių. Taip pat pridedamas mokestis už biomedžiagos paėmimą - apie 400 rublių.
