Srauto citometrija yra citologinis tyrimo metodas, naudojamas nuodugniai ląstelių analizei. Jo pranašumas yra tas, kad jis leidžia ištirti kiekvieną ląstelę atskirai. Šio tipo analizė padeda per kelias sekundes įvertinti kelis parametrus šimtuose langelių. Todėl citofluorimetrija laikoma vienu greičiausių ir tiksliausių šiuo metu mokslininkams ir gydytojams prieinamų analizės metodų.
Principas
Srauto citometrijos principas pagrįstas šviesos sklaidos ir ląstelių liuminescencijos (fluorescencijos) matavimu. Ląstelių suspensija dideliu greičiu praleidžiama per citometro ląstelę, kur ji apšvitinama lazeriu. Ten taip pat atliekamas vadinamasis hidrodinaminis fokusavimas. Jo mechanizmas yra toks, kad srautas iš ląstelės su tiriamomis dalelėmis išleidimo angoje patenka į išorinę čiurkšlę, kuri turi didesnį greitį. Dėl to dalelės sulygiuotos į tvarkingą grandinę.
Išankstinės ląstelės yra paženklintos specialiais fluorescenciniais dažais (fluorochromais). Jų dėka lazerio spindulyssužadina antrinį švytėjimą. Gauti šviesos signalai registruojami detektoriais. Vėliau informacija apdorojama naudojant programinės įrangos algoritmus, kurie leidžia suskaičiuoti atskiras ląstelių populiacijas, kurios skiriasi kai kuriais kriterijais.
Tyrimai naudojant įprastinę mikroskopiją dažnai nesugeba atskirti skirtingų ląstelių, nes jos atrodo vienodai. Citofluorimetrija gali pateikti kitus duomenis (DNR struktūros vientisumą), analizuoti b altymų ekspresiją, ląstelių išgyvenimą.
Kadangi fluorochromams sužadinti reikalingi skirtingo bangos ilgio šviesos pluoštai, taip pat skirtingų tipų detektoriai, šiuolaikinėse instaliacijose įrengti keli aptikimo kanalai (nuo 4 iki 30). Lazerinių spindulių skaičius gali būti nuo 1 iki 7. Sudėtingesni įrenginiai leidžia vienu metu atlikti kelių dalelių savybių kelių parametrų tyrimus.
Privalumai ir trūkumai
Srauto citometrijos pranašumai:
- didelis apdorojimo greitis (iki 30 tūkst. įvykių registracija per 1 sekundę);
- galimybė ištirti daug ląstelių (iki 100 mln. imtyje);
- Fluorescencinės šviesos intensyvumo kiekybinis įvertinimas;
- kiekvienos ląstelės analizė;
- vienalaikis nevienalyčių procesų tyrimas;
- automatinis duomenų atskyrimas pagal ląstelių populiacijas;
- kokybiška rezultatų vizualizacija.
Kita šios technologijos savybė yra taanalizuojama dalelė gali būti nudažyta keliais fluorescenciniais tirpalais. Dėl to atliekamas kelių parametrų tyrimas.
Trūkumai apima techninės įrangos sudėtingumą ir specialaus mėginio paruošimo poreikį.
Citometrai
Pirmieji tokio tipo įrenginiai Vokietijoje pasirodė jau 1968 m., tačiau plačiai paplito daug vėliau. Šiuo metu visus prietaisus, veikiančius srauto citometrijos metodu, galima suskirstyti į 2 tipus:
- prietaisai, matuojantys fluorescencinę spinduliuotę (du ar daugiau bangų ilgių), 10° ir 90° šviesos sklaidą (mažo kampo ir šoninės sklaidos detektorius);
- įrenginiai, kurie, be kelių korinio ryšio parametrų matavimo, automatiškai rūšiuoja į grupes pagal šiuos kriterijus.
Priekinės sklaidos detektorius skirtas ląstelės dydžiui nustatyti, o šoninio sklaidos įtaisas leidžia gauti informaciją apie intraląstelinių granulių buvimą, citoplazmos ir branduolio tūrio santykį.
Klasikiniai citometrai, skirtingai nei šviesos mikroskopai, neleidžia gauti ląstelės vaizdo. Tačiau pastaraisiais metais buvo sukurti kombinuoti prietaisai, kurie gali sujungti mikroskopo ir citofluorimetro galimybes. Jie bus aptarti toliau.
Vaizdo citometrai
Klasikinėje srauto citometrijoje naudojamiems instrumentams,būdingas vienas požymis: jei analizuojamų ląstelių populiacijoje registruojami reti reiškiniai, tai nėra galimybės įvertinti, kokia jų esmė. Šios dalelės gali būti negyvų ląstelių liekanos arba reta jų grupė. Įprastuose įrenginiuose tokie duomenys neįtraukiami į bendrą įvykių srautą, tačiau būtent jie gali būti ypač vertingi atliekant mokslinę ir klinikinę analizę.
Naujos kartos vaizdo srauto citometrai leidžia užfiksuoti kiekvienos ląstelės, einančios srautu per detektoriaus zoną, vaizdą. Jį lengva pamatyti spustelėjus atitinkamą diagramos sritį, kuri rodoma kompiuterio monitoriuje.
Taikymo sritys
Srauto citometrija yra universalus metodas, naudojamas daugelyje medicinos ir mokslo sričių:
- imunologija;
- onkologija;
- transplantologija (raudonųjų kaulų čiulpų, kamieninių ląstelių transplantacija);
- hematologija;
- toksikologija;
- biochemija (rūgštingumo matavimas ląstelės viduje, kitų parametrų tyrimas);
- farmakologija (naujų vaistų kūrimas);
- mikrobiologija;
- parazitologija ir virusologija;
- okeanologija (fitoplanktono tyrimas vandens telkinių būklei įvertinti ir kitos užduotys);
- nanotechnologijos ir mikrodalelių analizė.
Imunologija
Žmogaus imuninė sistema susideda iš daugybės ląstelių. Srauto citometrija imunologijoje leidžia įvertinti jų struktūrą ir funkcijas, ty atlikti morfofunkcinius.analizė.
Tokie tyrimai padeda suprasti sudėtingą imuniteto prigimtį. Ląstelių fenotipai keičiasi dėl antigenų aktyvavimo, patologijų vystymosi ir kitų veiksnių. Citofluorometrija gali atskirti imuninių ląstelių pogrupius sudėtingame mišinyje ir įvertinti visus jų pokyčius laikui bėgant.
Onkologija
Viena iš svarbiausių onkologinių užduočių – ląstelių diferenciacija pagal jų tipą. Srauto citometrijos analizės principas onkohematologijoje grindžiamas tokiu reiškiniu: kai mėginys apdorojamas specialiais fluorescenciniais dažais, jis prisijungia prie citoplazmos b altymų. Po dalijimosi aktyviai besidauginančiose ląstelėse jo kiekis sumažėja per pusę. Atitinkamai, ląstelės liuminescencijos intensyvumas sumažėja dvigubai.
Yra ir kitų būdų, kaip aptikti besidauginančias ląsteles:
- DNR surišančių dažiklių (propidžio jodido) naudojimas;
- pažymėto uracilo naudojimas;
- padidėjusio ciklino b altymų, dalyvaujančių reguliuojant ląstelių ciklą, ekspresijos registracija.
